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方法与工具Nucleic Acids Research · 模块化蛋白克隆方法开发

HURDLER：突破设计型重复蛋白长度限制的克隆方法

HURDLER: a cloning method to overcome length limits in designed repeat proteins.

一句话提出HURDLER模块化克隆策略，突破长重复蛋白构建中的内部重复模块数量限制。

研究问题

如何在减少单独克隆步骤的同时，高保真地构建含大量内部重复模块的长蛋白，并获得重复次数明确的中间变体？

数据与样本

研究对象为设计型犰狳重复蛋白，构建体最多含85个内部模块，对应>3700个氨基酸残基。最终构建体及部分中间体采用Oxford Nanopore Technology进行全质粒测序，DNA序列已存入GenBank，编号为PZ092331–PZ092357。

分析流程

  1. 1序列优化：用自定义Python遗传算法对500条候选序列迭代800代，通过加权惩罚函数减少内部8–13mers重复、高局部GC含量、潜在发卡结构和非预期限制性酶切位点，并去除稀有密码子。
  2. 2初始构建：将优化序列合成为gBlocks并克隆至pET28a质粒，在DH5α细胞中完成质粒构建。
  3. 3递归延长：结合无缝插入的限制性酶切位点开展改良递归定向连接，重复酶切、凝胶纯化、连接、转化及筛选，持续使用同一批预制次级片段。
  4. 4构建体筛选与确认：每轮选择6个菌落进行培养和质粒提取，通过诊断性酶切及琼脂糖凝胶电泳选出下一轮受体，并用纳米孔测序确认目标构建体。
  5. 5蛋白表达与纯化：在共转化表达T7 RNA polymerase的pQE30质粒的NEB Stable Cells中表达，经Ni-NTA亲和纯化、TEV切除标签及反向Ni-NTA纯化获得蛋白。
  6. 6色谱分析：使用体积排阻色谱监测280 nm吸光度与488 nm荧光，通过MATLAB包chromatography提取原始数据，并用内部Python脚本分析。
  7. 7形态表征：对纯化蛋白开展负染电子显微镜观察，使用EMAN2转换图像格式，再用CryoSPARC进行颗粒挑选和2D分类。

关键方法与工具

HURDLER
模块化构建长重复蛋白
genetic algorithm
优化编码序列
Oxford Nanopore Technology (ONT)
全质粒序列确认
Ni-NTA
蛋白亲和纯化
Size-exclusion chromatography
分析蛋白洗脱谱
chromatography
提取原始色谱数据
EMAN2
转换电镜图像格式
CryoSPARC
颗粒挑选与2D分类

设计思路

将编码序列优化与模块化递归连接结合，分别处理重复DNA序列设计和逐轮扩增长度的问题；每轮通过诊断性酶切筛选，最终以全质粒测序确认构建体。保留重复次数明确的中间变体，为后续系统比较模块数量与蛋白结构、功能的关系提供材料，并通过表达纯化、色谱和负染电镜开展表征。

主要发现

  • HURDLER成功构建了含多达85个内部模块的设计型犰狳重复蛋白，对应>3700个氨基酸残基。
  • 该策略能够生成内部重复次数明确的中间变体，为系统研究模块数量对蛋白结构和功能的影响提供材料。
  • 该模块化策略可用于包含非重复部分的大型重复蛋白DNA克隆。
  • 方法部分报告，重复蛋白的表达纯化产量为10至40 mg/l培养物。

可借鉴之处

  • 构建高度重复序列时，可借鉴本文将重复片段、局部GC含量、发卡结构和非预期酶切位点纳入同一加权惩罚函数的序列优化思路。
  • 递归构建时复用同一批次级片段，并以每轮诊断性酶切筛选衔接最终全质粒测序，可作为长重复构建体的分层质控流程。
  • 不要只保留最长构建体：本文生成重复次数明确的中间变体，可供后续研究模块数量与结构、功能的关系。

数据与代码

HURDLER流程、源代码及原始测序数据见https://github.com/Wenzhao-protein/clone_repeat_protein及Zenodo镜像（DOI: 10.5281/zenodo.22787559），DNA序列见GenBank（PZ092331–PZ092357），DNA与氨基酸序列见补充表S2和S3，其他补充数据见NAR在线材料。

摘要（中文翻译）

内部重复模块的数量仍是构建长重复蛋白及探索其功能的主要限制因素。为解决这一问题，我们提出了用于延长重复蛋白的高效递归定向连接方法（High-Utility Recursive Directional Ligation for Extended Repeat proteins，HURDLER），这是一种结合密码子优化、限制性酶切位点无缝插入和改良递归定向连接的模块化克隆策略。该技术非常稳健，仅需尽可能少的单独克隆步骤，即可高保真地克隆大型重复蛋白的DNA，这些蛋白也可包含非重复部分。利用HURDLER，我们克隆了含多达85个内部模块的设计型犰狳重复蛋白，对应>3700个氨基酸残基。该方法还可生成具有明确内部重复次数的中间变体，从而能够系统研究模块数量如何影响蛋白质的结构和功能。因此，HURDLER为突破构建超长重复蛋白时内部模块总数的限制提供了可靠的解决方案。这类蛋白正日益被用作具有确定结构的大分子蛋白质组装体的构建单元。

英文原文摘要

The number of internal repeat modules remains a major limiting factor in the construction and functional exploration of long repeat proteins. As a solution, we present High-Utility Recursive Directional Ligation for Extended Repeat proteins (HURDLER)-a modular cloning strategy combining codon optimization, seamless insertion of restriction sites, and modified recursive directional ligation. It presents a very robust technique to clone DNA for large repeat proteins, which may also contain non-repetitive parts, with high fidelity requiring a minimal number of individual cloning steps. Using HURDLER, we cloned designed armadillo repeat proteins with up to 85 internal modules, corresponding to >3700 residues. The method also generates intermediate variants with defined numbers of internal repeats, enabling systematic investigation of how the number of modules influences protein structure and function. HURDLER thereby provides a reliable solution to overcome restrictions in the overall number of internal modules used in the construction of very long repeat proteins. Such proteins are increasingly utilized as building blocks in macromolecular protein assemblies with defined structures.

摘要来自 PubMed。翻译与解读由模型根据摘要和开放获取全文的方法部分生成，可能有误，不构成诊疗建议；数据以原文为准，版权归原出版方所有。