化学稳定化的长反义寡核苷酸扰乱RNA外切体功能
Chemically stabilized long antisense oligonucleotides perturb RNA exosome function.
一句话在细胞模型中，长化学稳定化寡核苷酸可干扰RNA外切体，调整修饰可减轻干扰并保留编辑活性。
研究问题
数据与样本
实验流程
- 1鉴定相互作用蛋白：通过邻近生物素化蛋白质组学，检测化学稳定化寡核苷酸与RNA外切体亚基的结合。
- 2评估外切体功能：检测启动子上游转录本的剂量依赖性稳定化、核糖体RNA加工中间体积累及细胞活力变化。
- 3考察长度依赖性：分析寡核苷酸长度与外切体功能干扰的关系。
- 4解析修饰效应：系统改变核糖与骨架化学结构，考察修饰空间排列、2'-MOE残基及替代性核苷间连接对外切体抑制的影响。
- 5验证编辑与干扰的兼容性：设计ADAR招募型寡核苷酸，评估其能否保留编辑活性并尽量减少外切体干扰。
关键方法与工具
- proximity biotinylation proteomics
- 鉴定寡核苷酸结合蛋白
设计思路
主要发现
- 外切体催化亚基DIS3和EXOSC10优先结合经2'-核糖修饰和硫代磷酸酯键稳定化的寡核苷酸。
- RNA药物结合与外切体功能受损相关，表现为启动子上游转录本呈剂量依赖性稳定化、核糖体RNA加工中间体积累及细胞活力下降。
- 长度超过24个核苷酸的寡核苷酸可损害外切体功能，与底物穿过外切体通道的结构要求一致。
- 外切体抑制对化学修饰的空间排列高度敏感，引入体积较大的2'-MOE残基或甲磺酰基氨基磷酸酯等替代性核苷间连接可减轻抑制。
- ADAR招募型寡核苷酸可以通过设计，在保留编辑活性的同时尽量减少外切体干扰。
可借鉴之处
- 研究寡核苷酸非预期作用时，可借鉴本文将邻近生物素化蛋白质组学与靶复合体功能读出相衔接的思路，避免仅凭结合结果判断功能影响。
- 优化化学修饰时，可像本文一样系统考察长度、修饰空间排列和骨架连接，而不只比较是否存在某种修饰。
- 开发ADAR招募型寡核苷酸时，可同时评估编辑活性与外切体干扰，寻找保留功能且减少非预期干扰的设计。
数据与代码
局限
- 所述证据来自细胞层面的相互作用与功能实验，不能直接确定患者中的安全性。
摘要（中文翻译）
与细胞内蛋白质的相互作用塑造了gapmers和siRNAs等RNA药物的药理作用与毒性。在此，我们鉴定出RNA外切体是长链、化学稳定化单链RNA药物的一种对修饰敏感的相互作用伙伴。通过邻近生物素化蛋白质组学，我们观察到外切体催化亚基DIS3和EXOSC10优先结合经2'-核糖修饰和硫代磷酸酯键稳定化的寡核苷酸。RNA药物结合与外切体功能受损相关，后者表现为启动子上游转录本呈剂量依赖性稳定化，以及核糖体RNA加工中间体积累，进而导致细胞活力下降。与底物穿过外切体通道的结构要求一致，长度超过24个核苷酸的寡核苷酸可损害外切体功能。对核糖和骨架化学结构进行系统性改变表明，外切体抑制对化学修饰的空间排列高度敏感，并且可通过引入体积较大的2'-MOE残基或甲磺酰基氨基磷酸酯等替代性核苷间连接来减轻。与临床已确立的RNA药物形式相比，新兴的ADAR招募型寡核苷酸所具有的类别特异性风险仍缺乏充分认识。重要的是，我们证明可以设计出在保留编辑活性的同时尽量减少外切体干扰的ADAR招募型寡核苷酸。这些发现阐明了在更安全地设计下一代RNA碱基编辑治疗药物时必须考虑的关键变量。
英文原文摘要
The interaction with intracellular proteins shapes the pharmacology and toxicity of RNA drugs like gapmers and siRNAs. Here, we identify the RNA exosome as a modification-sensitive interaction partner of long, chemically stabilized, single-stranded RNA drugs. Using proximity biotinylation proteomics, we observe preferential binding of the catalytic exosome subunits DIS3 and EXOSC10 to oligonucleotides stabilized by 2'-ribose modifications and phosphorothioate linkages. RNA drug binding correlates with exosome impairment as measured by dose-dependent stabilization of promoter upstream transcripts and accumulation of ribosomal RNA processing intermediates leading to reduced cell viability. Consistent with structural requirements for substrate threading through the exosome channel, oligonucleotides longer than 24 nucleotides can impair exosome function. Systematic variation of ribose and backbone chemistry reveals that exosome inhibition is highly sensitive to the spatial arrangement of chemical modifications and can be mitigated by incorporation of bulky 2'-MOE residues or alternative internucleoside linkages like mesyl phosphoramidate. In contrast to the clinically established RNA drug modalities, class-specific liabilities of emerging ADAR-recruiting oligonucleotides remain poorly understood. Importantly, we demonstrate that ADAR-recruiting oligonucleotides can be designed that preserve editing activity while minimizing exosome interference. These findings illuminate critical variables that must be considered in the safer design of next-generation RNA base editing therapeutics.
摘要来自 PubMed。翻译与解读由模型根据摘要生成，可能有误，不构成诊疗建议；数据以原文为准，版权归原出版方所有。