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实验研究Cell Systems · 细胞模型机制研究

CRISPR 相关酶在 iPSC 来源神经元中错误定位于细胞质，导致 KRAB(KOX1) 特异性降解

CRISPR-associated enzymes are mislocalized to the cytoplasm in iPSC-derived neurons, resulting in KRAB(KOX1)-specific degradation.

一句话在 iPSC 来源神经元中，核定位异常导致 KRAB(KOX1) 特异性降解，更换核定位信号可恢复表达。

研究问题

iPSC 分化为神经元后，dCas9-KRAB(KOX1) 蛋白表达下降是否与核定位异常及细胞质降解有关？更换核定位信号能否恢复其核定位与蛋白表达？

数据与样本

研究使用 iPSC 及 Ngn2 来源神经元，比较 dCas9-KRAB(KOX1)、nCas9 等 CRISPR 构建体的表达和定位。

实验流程

  1. 1比较分化前后表达：检测 CRISPR 酶在 iPSC 与 Ngn2 来源神经元中的表达变化。
  2. 2比较构建体差异：对比 dCas9-KRAB(KOX1) 与 nCas9 构建体分化后的蛋白水平。
  3. 3考察亚细胞定位：比较主要依赖 SV40 NLS 的 CRISPR 构建体在 iPSC 与神经元中的核定位，并考察 KRAB(KOX1) 特异性细胞质降解。
  4. 4开展恢复实验：测试其他 NLS，观察神经元中的核定位和蛋白表达能否恢复。

关键方法与工具

dCas9-KRAB(KOX1)
考察蛋白表达与定位
nCas9
比较分化后蛋白水平
SV40 nuclear localization signal (NLS)
考察神经元核定位

设计思路

通过比较 iPSC 与分化后神经元，判断表达和定位异常是否随分化出现；通过比较 dCas9-KRAB(KOX1) 与 nCas9，考察不同构建体的差异。进一步更换 NLS 并观察定位与表达恢复，为错误定位参与蛋白不稳定提供干预证据。

主要发现

  • 在 iPSC 分化为神经元后，dCas9-KRAB(KOX1) 蛋白水平显著下降，而 nCas9 构建体保持相近水平。
  • 主要依赖 SV40 NLS 的 CRISPR 构建体在 iPSC 中具有较高核内水平，但在神经元中无法实现核定位，并出现 KRAB(KOX1) 特异性细胞质降解。
  • 测试其他 NLS 可恢复神经元中的核定位与蛋白表达，支持错误定位促成 dCas9-KRAB(KOX1) 的不稳定性。

可借鉴之处

  • 研究分化后转基因表达丢失时，可借鉴本文同时检查蛋白水平与亚细胞定位的做法，而不只将其归因于转基因沉默。
  • 将分化前后比较、不同构建体比较与 NLS 更换恢复实验串联，可用于区分细胞状态、构建体组成与定位异常对蛋白稳定性的影响。

数据与代码

摘要和已读取的内容里没有说明，请查看原文的数据可得性声明。

局限

  • 研究证据来自 iPSC 及其来源神经元细胞模型，能否推广到其他有丝分裂后细胞及体内模型仍需进一步研究。

摘要（中文翻译）

与分裂细胞系相比，在诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元中使用 CRISPR 相关酶面临独特挑战。例如，已有研究观察到分化后 dCas9-KRAB 表达丢失，并主要将其归因于转基因沉默。在本研究中，我们考察了 CRISPR 酶在 iPSC 和 Ngn2 来源神经元中的表达。我们发现，常用的 dCas9-KRAB(KOX1) 在分化后蛋白水平显著下降，而 nCas9 构建体则保持了相近的水平。我们进一步发现，主要依赖 SV40 核定位信号（NLS）的 CRISPR 构建体，尽管在 iPSC 中具有较高的核内水平，却无法定位到神经元的细胞核中，从而导致 KRAB(KOX1) 特异性的细胞质降解。通过测试其他 NLS，我们恢复了神经元中的核定位和蛋白表达，证实错误定位促成了 dCas9-KRAB(KOX1) 在神经元中的不稳定性。由于缺乏核定位可能对 CRISPR 活性产生深远影响，我们建议在培养及体内的有丝分裂后细胞模型中开展进一步研究。本文透明同行评审过程的记录收录于补充信息中。

英文原文摘要

The use of CRISPR-associated enzymes in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived neurons presents unique challenges compared with dividing cell lines. For example, loss of dCas9-KRAB expression after differentiation has been observed and largely ascribed to transgene silencing. Here, we investigated the expression of CRISPR enzymes in iPSCs and Ngn2-derived neurons. We found that the commonly used dCas9-KRAB(KOX1) displayed a dramatic reduction in protein levels following differentiation, yet nCas9 constructs retained comparable levels. We further found that CRISPR constructs, primarily relying on the SV40 nuclear localization signal (NLS), fail to localize to the nuclei of neurons, despite having robust nuclear levels in iPSCs, leading to KRAB(KOX1)-specific cytoplasmic degradation. By testing other NLSs, we rescued neuronal nuclear localization and protein expression, confirming the contribution of mislocalization to the instability of dCas9-KRAB(KOX1) in neurons. As the lack of nuclear localization can have a profound impact on CRISPR activity, we suggest further investigation across cultured and in vivo postmitotic cell models. A record of this paper's transparent peer review process is included in the supplemental information.

摘要来自 PubMed。翻译与解读由模型根据摘要生成，可能有误，不构成诊疗建议；数据以原文为准，版权归原出版方所有。