实验研究Commun Biol · 细菌生境适应与毒力实验研究

金黄色葡萄球菌对活性氧的抵抗、抗生素耐受性及毒力依赖于其生境

Biotope-dependent resistance to reactive oxygen species, antibiotic tolerance, and virulence of Staphylococcus aureus.

一句话乳中培养的金黄色葡萄球菌更耐受活性氧和抗菌药物，并在幼虫感染模型中加速致死。

论文图表（7）

Fig. 1：这张图比较 S. aureus 在血清、乳和 BHI 中的生长、膜脂肪酸组成及膜流动性，显示其能够掺入环境提供的外源脂肪酸。血清和乳培养条件下的膜脂肪酸谱及膜流动性存在差异。 — Fig. 1　这张图比较 S. aureus 在血清、乳和 BHI 中的生长、膜脂肪酸组成及膜流动性，显示其能够掺入环境提供的外源脂肪酸。血清和乳培养条件下的膜脂肪酸谱及膜流动性存在差异。
S. aureus 在血清或乳中的生长及外源 FA 掺入。a 通过在给定时间点将稀释液涂布于 BHI 琼脂上，测定成年牛血清、全乳和 BHI 液体培养基中的 CFUs，以评估 S. aureus JE2 的生长。数据表示三次独立实验的均值 ± SD。b 比较在血清、乳或 BHI 中生长的 JE2 (WT) 及其 ΔfabD FA 营养缺陷型衍生株的膜 FA 谱。在 BHI 中培养的 JE2 菌株（红色谱线）通过 FASII 合成 FAs，其 FA 谱以 ai15、其延长产物 (ai17, ai19) 及饱和直链 FAs (C16:0, C18:0, C20:0) 为主。相比之下，血清（绿色）或乳（蓝色）中的 JE2 FA 谱均富集了培养基提供的外源 FAs。FA 营养缺陷株 ΔfabD 的 FA 谱与其相应培养基的 FA 谱相似。峰高对应于样本中各 FA 的相对响应 (mV)。标出了主要 FAs；N = 3。c FA 种类以总量调整至 100% 后的比例呈现。所示为三次独立实验的平均值。各样本中每种 FA 的比例见补充表 1。d 使用 Laurdan 广义极化方法 (Laurdan GP) 评估在不同培养基中生长的 WT JE2 及其 ΔfabD 衍生株的膜流动性。Laurdan GP = (I440 − I490)/(I440 + I490)，其中 I440 和 I490 分别为在 350 nm 激发时、440 和 490 nm 处的发射强度。图中显示各个数据点（n = 6 个生物学独立样本）及均值 ± SD。P 值通过单因素 ANOVA 确定 (***p < 0.0001; **p < 0.0008)。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 2：不同培养环境下，S. aureus JE2 的细胞包膜形态、厚度及细胞大小存在差异。牛奶组包膜更厚，而血清组细胞更小。 — Fig. 2　不同培养环境下，S. aureus JE2 的细胞包膜形态、厚度及细胞大小存在差异。牛奶组包膜更厚，而血清组细胞更小。
血清和牛奶调节 S. aureus 的细胞包膜。a 在牛奶和血清中培养至饱和的 JE2 细菌的代表性透射电子显微镜图像。同时展示在 BHI 中培养的细胞以供比较。箭头指示包膜厚度。上排图的比例尺为 500 nm。放大图展示了 3 种条件下 S. aureus 包膜形态的显著差异。b 在 BHI、成年牛血清或全脂牛奶中培养的 JE2 的细胞包膜厚度范围，以及 c 细胞大小，均使用 ImageJ 在显微图像横截面上测定。每个圆圈代表一个细胞的一次测量。各子图的箱线图展示直径分布的中位数（箱内粗线）和变异程度（箱体幅度）。误差线表示 SD。统计显著性通过单因素 ANOVA 确定（***p < 0.0001; *, p < 0.0160）。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 3：血清和牛奶培养条件使 S. aureus 呈现不同的包膜性质，包括肽聚糖可及性、通透性、自溶敏感性、表面电荷和疏水性。相较血清组，牛奶组的肽聚糖可及性更低、自溶更少，表面负电荷较弱且疏水性更强。 — Fig. 3　血清和牛奶培养条件使 S. aureus 呈现不同的包膜性质，包括肽聚糖可及性、通透性、自溶敏感性、表面电荷和疏水性。相较血清组，牛奶组的肽聚糖可及性更低、自溶更少，表面负电荷较弱且疏水性更强。
S. aureus 的物理特征受到血清和牛奶的差异性调节。在 BHI、成年牛血清或全脂牛奶中制备的 JE2，经洗涤并重悬于 PBS 后，用于评估包膜性质。a 使用外源性荧光探针 BODIPY™ FL-vancomycin (3 µg/mL) 测定肽聚糖的可及性。在 488 nm 处测量荧光，并使用 ImageJ 进行定量。图中表示每种条件下 3 次独立实验的 mean ± SD。b 通过 EtBr 扩散测定法37评估细菌通透性。对在 37 °C 下孵育的细菌进行 EtBr 处理并持续监测，EtBr 在进入细胞后发出荧光。在 60 min 内每隔 1 min 读取一次荧光（激发和发射波长分别为 530 和 600 nm）。数值表示 3 个生物学独立样本的均值。c 比较在时间 0 重悬于含 0.5% Triton X-100 的 PBS 中的细胞对自溶的敏感性。数据表示 n = 3 个生物学独立样本的 mean ± SD。d 通过电泳迁移率测量细胞表面电荷，电泳迁移率由悬浮于 PBS 中的细菌培养物的 zeta 电位确定。数据代表 5 次独立测定，每次测定有 3 个重复，并以 mean ± SD 表示。e 根据细菌在 PBS 与二甲苯溶剂之间的亲和性测定疏水性。通过测量混合前后水相中的 OD600，估计细菌黏附于液态烃的亲和性。结果显示生物学独立三重复的平均值和范围。P 值通过单因素 ANOVA 确定（****p < 0.00001; ***p < 0.0001; **p < 0.0008; *p = 0.0160）。f 基于上述物理特征，比较牛奶和血清感染条件下 S. aureus 包膜特性的示意性总结。源数据以 Supplementary Data 3 文件提供。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 3a 的 R 复现图 — Fig. 3　血清和牛奶培养条件使 S. aureus 呈现不同的包膜性质，包括肽聚糖可及性、通透性、自溶敏感性、表面电荷和疏水性。相较血清组，牛奶组的肽聚糖可及性更低、自溶更少，表面负电荷较弱且疏水性更强。
S. aureus 的物理特征受到血清和牛奶的差异性调节。在 BHI、成年牛血清或全脂牛奶中制备的 JE2，经洗涤并重悬于 PBS 后，用于评估包膜性质。a 使用外源性荧光探针 BODIPY™ FL-vancomycin (3 µg/mL) 测定肽聚糖的可及性。在 488 nm 处测量荧光，并使用 ImageJ 进行定量。图中表示每种条件下 3 次独立实验的 mean ± SD。b 通过 EtBr 扩散测定法37评估细菌通透性。对在 37 °C 下孵育的细菌进行 EtBr 处理并持续监测，EtBr 在进入细胞后发出荧光。在 60 min 内每隔 1 min 读取一次荧光（激发和发射波长分别为 530 和 600 nm）。数值表示 3 个生物学独立样本的均值。c 比较在时间 0 重悬于含 0.5% Triton X-100 的 PBS 中的细胞对自溶的敏感性。数据表示 n = 3 个生物学独立样本的 mean ± SD。d 通过电泳迁移率测量细胞表面电荷，电泳迁移率由悬浮于 PBS 中的细菌培养物的 zeta 电位确定。数据代表 5 次独立测定，每次测定有 3 个重复，并以 mean ± SD 表示。e 根据细菌在 PBS 与二甲苯溶剂之间的亲和性测定疏水性。通过测量混合前后水相中的 OD600，估计细菌黏附于液态烃的亲和性。结果显示生物学独立三重复的平均值和范围。P 值通过单因素 ANOVA 确定（****p < 0.00001; ***p < 0.0001; **p < 0.0008; *p = 0.0160）。f 基于上述物理特征，比较牛奶和血清感染条件下 S. aureus 包膜特性的示意性总结。源数据以 Supplementary Data 3 文件提供。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 4：该图比较 JE2 在 BHI、血清和乳中培养后的蛋白质组，显示三种条件共享大量蛋白质，但脂肪酸合成、毒力和应激反应相关蛋白的丰度模式存在差异。图中 e、f 的功能标题与英文图注的对应顺序相反。 — Fig. 4　该图比较 JE2 在 BHI、血清和乳中培养后的蛋白质组，显示三种条件共享大量蛋白质，但脂肪酸合成、毒力和应激反应相关蛋白的丰度模式存在差异。图中 e、f 的功能标题与英文图注的对应顺序相反。
在 BHI、血清和乳中培养的 S. aureus 的比较蛋白质组学。a 研究流程图。在三种条件（BHI、成年牛血清或全脂乳）下培养的细菌，各设五个独立重复，过夜培养后从琼脂平板收集，并进行蛋白质组学分析处理。使用 BioRender 创建。Vidic, J. (2026) https://BioRender.com/xnjr53d b 维恩图显示基于五个生物学重复在各条件下检测到的已鉴定蛋白质数量。完整数据见 Supplementary Data 1。c 火山图展示比较血清和乳培养条件下 JE2 表达蛋白水平的变化幅度（log2 fold change）和统计显著性（q-value）。水平虚线表示倍数变化阈值，垂直虚线表示统计显著性阈值（q-value = 0.05）。比较血清与乳培养条件时，红点表示显著上调的蛋白质，蓝点表示显著下调的蛋白质。血清与 BHI 以及乳与 BHI 的火山图比较见 Supplementary Fig. 6。与 d FASII 通路、e 应激反应和 f 毒力相关的显著差异蛋白质热图（Z-scored），比较在 BHI、血清和乳中培养的 JE2。表达水平色标显示在左侧。每种条件的全部五个样本均予以展示。颜色梯度图例的单位代表经缩放的 LFQ 强度，蓝色表示较低的蛋白质丰度，红色表示较高的蛋白质丰度。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 5：牛奶中生长的 JE2 呈现明显色素沉着，其色素提取物显示类胡萝卜素相关吸收峰。脱脂后菌落颜色变浅，补充牛奶脂肪后颜色增强，支持牛奶脂质促进色素沉着。 — Fig. 5　牛奶中生长的 JE2 呈现明显色素沉着，其色素提取物显示类胡萝卜素相关吸收峰。脱脂后菌落颜色变浅，补充牛奶脂肪后颜色增强，支持牛奶脂质促进色素沉着。
牛奶中生长的 S. aureus 表现出明显的色素沉着，且牛奶脂质可促进这一现象。a 在成年牛血清、全脂牛奶和 BHI 中培养 JE2，在生长 24 h 和 48 h 后收集细胞沉淀，评估色素沉着。收集来自 2 mL 液体培养物的细胞沉淀，洗涤并拍照。b 从细胞中提取色素，并通过紫外-可见光谱法进行评估。三重峰源于类胡萝卜素金黄色葡萄球菌色素、4,4′-diaponeurosporene 和 4,4′-diapolycopene 的存在，分别位于 ~412 nm、435 nm 和 465 nm。该测定结果代表 3 次实验。c 将在 BHI 中制备的独立 JE2 培养物洗涤，并在 0.9% NaCl 中调整至 OD600 为 0.025。每份培养物取 5 µL，点种于添加了 40% 全脂牛奶、脱脂牛奶或补充了 4% 牛奶奶油的脱脂牛奶的 1.5% 无营养琼脂上。48 h 后对平板拍照。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 6：乳中培养的 S. aureus 在氧化应激后具有更高的存活比例，且对所测抗生素的 MIC 高于血清培养条件。图中同时展示了 crtM、katA 突变体的氧化应激存活情况，以及 crtM 突变体的抗生素 MIC。 — Fig. 6　乳中培养的 S. aureus 在氧化应激后具有更高的存活比例，且对所测抗生素的 MIC 高于血清培养条件。图中同时展示了 crtM、katA 突变体的氧化应激存活情况，以及 crtM 突变体的抗生素 MIC。
乳中培养的 S. aureus 对 ROS 和抗生素的耐受性增强，而 crtM 或 katA 突变体的耐受性降低。在成年牛血清或全乳条件下制备的 JE2 WT 和突变体培养物经洗涤后重悬于生理盐水中。a WT JE2 和 b crtM 转座子突变体77细菌不经处理或暴露于单线态氧，随后进行系列稀释，点种于 BHI 琼脂上并培养过夜，以确定存活情况。注意 a 和 b 的对数图刻度不同。实验至少重复三次。对于 JE2（a），取一份血清培养的细菌暴露于乳中 1 h，随后洗涤，再进行单线态氧处理（右侧）。其持续的高敏感性使我们能够排除乳结合细菌的非特异性影响。c 比较乳中与血清中培养的 WT JE2（补充图 11）和 katA 转座子突变体77对 H2O2 的敏感性。a–c 的结果代表至少 3 次独立实验。上部展示代表性实验的结果。注意，同一图像内的所有泳道均来自同时进行的实验，其中使用不同平板进行测定。下部图中的误差线为 SD。P 值通过普通单因素 ANOVA 确定（***p < 0.0002; **p < 0.0029; *p = 0.0422; ns，无显著性）。d MIC，24 h 后不同抗生素的最低抑菌浓度 a。在所示培养基中制备的饱和细菌培养物用相应培养基稀释并分装于 96 孔板。细菌暴露于按 2 倍梯度稀释的抗生素，浓度范围为 8 至 0.125 µg/mL（万古霉素）、0.5–0.0075 µg/mL（乳酸链球菌素）和（环丙沙星）。乳中细菌的存活情况通过稀释后点种于 BHI 琼脂上计算。结果报告为 3 次独立实验的均值。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

Fig. 7：这张图比较不同培养环境下 S. aureus 对大蜡螟幼虫的致死能力。牛奶培养组在感染早期的幼虫存活率最低，PBS 对照组在 72 小时内无死亡。 — Fig. 7　这张图比较不同培养环境下 S. aureus 对大蜡螟幼虫的致死能力。牛奶培养组在感染早期的幼虫存活率最低，PBS 对照组在 72 小时内无死亡。
S. aureus 的环境来源影响感染效能。使用 G. mellonella 感染模型，比较了在成年牛血清、全脂牛奶或 BHI 中培养的 S. aureus 的感染能力。使用 BioRender 创建。Vidic, J. (2026) https://BioRender.com/b5jturg a 体内感染实验示意图。用来自这 3 种条件的 106 CFUs S. aureus JE2 感染幼虫。实验对照组接受 PBS。通过黑化评估幼虫死亡情况。不同长度的箭头表示拍摄处理后幼虫照片的时间点。用牛奶中培养的 S. aureus 攻击后仅 24 h 就观察到高死亡率（幼虫颜色由乳白色变为深灰色），而对照实验中即使在 72 h 后也未观察到死亡。b 在 24 h、48 h 和 72 h 后计数存活幼虫（n = 20 larvae/group；3 次独立实验）；PBS 处理的幼虫未出现死亡。采用 Kaplan-Meier 方法分析数据，合并生物学独立三重复的数值（每种条件 60 个样本）。使用 log-rank (Mantel-Cox) 检验比较生存曲线。标出了 3 组之间的显著性：***p < 0.001；*p > 0.05；ns：无统计学显著性。
图片来自 Commun Biol（Léguillier V, et al.），doi:10.1038/s42003-026-10771-2，按 CC BY 4.0 许可原样转载。

研究问题

乳与血清这2种感染相关生境是否会改变金黄色葡萄球菌的包膜、脂质和蛋白质组特征，以及抗氧化能力、抗菌药物耐受性和毒力？乳脂及色素生成在其中起什么作用？

数据与样本

研究使用金黄色葡萄球菌菌株，包括USA300-JE2及其∆fabD突变株，在BHI、成年牛血清及乳相关培养条件下开展实验。JE2的BHI、血清和乳培养组各制备5个独立重复用于蛋白质组学分析，采用nanoLC-MS/MS；另使用大蜡螟（G. mellonella）感染模型评估毒力。

实验流程

1建立生境对照：将细菌适应培养于血清或乳，再在对应固体培养基上培养，收集并洗涤后用于检测，同时设置BHI培养条件。
2构建遗传材料：利用pMad载体和同源重组构建USA300-JE2的fabD缺失突变株，通过菌落PCR和DNA测序确认。
3刻画包膜与膜脂：测定脂肪酸谱、Laurdan广义极化、包膜厚度、万古霉素结合、通透性、自溶、电泳迁移率及表面疏水性。
4比较蛋白质组：对BHI、血清及乳培养的JE2各取5个独立重复，进行蛋白提取、消化及nanoLC-MS/MS分析。
5评估色素与胁迫表型：通过光谱法定量金黄色葡萄球菌色素，并检测ROS敏感性及抗生素相关表型，比较乳脂条件下的变化。
6验证毒力表型：在大蜡螟幼虫感染模型中比较不同培养条件下细菌的致死表现。

关键方法与工具

Gibson: 组装fabD缺失构建载体
TotalChrom: 分析脂肪酸气相色谱数据
Laurdan generalized polarization (GP): 测定细菌膜流动性
Transmission electron microscopy (TEM): 观察细菌包膜结构
ImageJ: 定量包膜厚度与细胞染色
ANOVA: 比较包膜厚度
nanoLC-MS/MS: 进行蛋白质组检测
G. mellonella virulence assay: 评估幼虫感染毒力

设计思路

以乳与血清培养构成核心生境对照，并加入BHI条件，通过洗涤减少残留培养基对后续检测的影响；脂肪酸检测前专门去除可能黏附于菌体的培养基脂质。结合全脂乳、脱脂乳及补加乳脂条件，将生境差异进一步拆解至脂质因素，再以包膜、膜脂、蛋白质组、色素、胁迫耐受及幼虫毒力形成多层证据链。

主要发现

乳与血清培养的金黄色葡萄球菌在包膜物理性质、膜脂肪酸组成和刚性、色素生成及蛋白质组谱方面存在明显差异。
与血清培养相比，乳培养的金黄色葡萄球菌对ROS损伤表现出极强抵抗力，并具有显著的抗菌药物耐受性。
乳培养的金黄色葡萄球菌在幼虫感染模型中加速致死。
乳脂刺激全脂乳中金黄色葡萄球菌的高水平色素生成，而高水平色素是其高度抵抗ROS的原因。

可借鉴之处

研究感染相关细菌表型时，可借鉴本文将乳与血清作为培养环境对照的做法，检验生境是否改变标准培养条件下观察到的耐受与毒力。
分析细菌膜脂时，可借鉴本文在提取前专门清除黏附的外源脂质，减少将培养基成分误判为菌体脂质的可能。
可借鉴全脂乳、脱脂乳与补加乳脂的条件拆解思路，将复杂生境差异定位到具体组分，并结合分子检测与感染模型验证。

数据与代码

质谱蛋白质组数据存于ProteomeXchange的PRIDE库（PXD064173），图表源数据见Supplementary Data 1–3，携带pMad-plsX-∆fabD-fabG的菌株可向作者合理申请用于研究。

公共数据库

PRIDE PXD064173

表格类补充数据（复现用得上）

42003_2026_10771_MOESM3_ESM.xlsx286 KBSupplementary data 1
42003_2026_10771_MOESM4_ESM.xlsx40 KBSupplementary data 2
42003_2026_10771_MOESM5_ESM.xlsx66 KBSupplementary data3
42003_2026_10771_MOESM3_ESM.xlsx286 KBSupplementary data 1
42003_2026_10771_MOESM4_ESM.xlsx40 KBSupplementary data 2
42003_2026_10771_MOESM5_ESM.xlsx66 KBSupplementary data3

其他补充文件（6 个）

42003_2026_10771_MOESM1_ESM.pdf 1.2 MB Supplementary Information
42003_2026_10771_MOESM2_ESM.pdf 7 KB Description of Additional Supplementary Files
42003_2026_10771_MOESM6_ESM.pdf 1.5 MB Reporting Summary
42003_2026_10771_MOESM1_ESM.pdf 1.2 MB Supplementary Information
42003_2026_10771_MOESM2_ESM.pdf 7 KB Description of Additional Supplementary Files
42003_2026_10771_MOESM6_ESM.pdf 1.5 MB Reporting Summary

局限

毒力证据来自幼虫感染模型，不能直接等同于人类或家畜乳腺炎中的致病表现。
研究主要基于体外培养与实验感染，调整临床抗生素方案的提示尚非患者治疗研究的直接证据。

摘要（中文翻译）

金黄色葡萄球菌是人类和家畜的病原体，因抗生素治疗失败而构成重大临床挑战。其顽强生存能力主要归因于抗生素耐药性以及与持留现象有关的耐受机制。本研究考察了乳和血清这2种与感染相关的条件如何塑造金黄色葡萄球菌的致病特性及其抵御环境胁迫的能力。在乳与血清中培养的细菌，其细胞包膜物理性质、膜脂肪酸组成和刚性以及色素生成存在明显差异，并呈现不同的蛋白质组谱。与在血清中培养相比，在乳中培养的金黄色葡萄球菌对活性氧（ROS）损伤表现出极强的抵抗力、显著的抗菌药物耐受性，并在幼虫感染模型中加速致死。全脂乳中的乳脂可刺激金黄色葡萄球菌产生高水平色素，而这种高水平色素是其高度抵抗ROS的原因。金黄色葡萄球菌在乳生境中表现出的显著稳健性，可能提示治疗人类和家畜乳腺炎感染时需要调整抗生素方案。

英文原文摘要

The human and livestock pathogen Staphylococcus aureus poses a major clinical challenge due to antibiotic treatment failure. Its resilience is mainly attributed to antibiotic resistance and tolerance mechanisms related to persistence. Here we investigate how two infection-relevant conditions, milk and serum, shape S. aureus pathogenic properties and capacity to withstand environmental stresses. Milk- versus serum-grown bacteria show gross differences in envelope physical properties, membrane fatty acid composition and rigidity, and pigment production, and display distinct proteomic profiles. Compared to growth in serum, S. aureus grown in milk exhibits extreme resistance to ROS damage, marked antimicrobial tolerance, and accelerated killing in a larval infection model. High level S. aureus pigmentation in whole milk is stimulated by milk lipids, and is responsible for high ROS resistance. The remarkable robustness of S. aureus in a milk biotope may signal the need to adjust antibiotic regimens when treating mastitis infections in humans and livestock.

摘要来自 PubMed。翻译与解读由模型根据摘要和开放获取全文的方法部分生成，可能有误，不构成诊疗建议；数据以原文为准，版权归原出版方所有。