RiboBA：适用于多种核糖体测序实验方案、稳健识别开放阅读框的偏倚感知概率框架
RiboBA: a bias-aware probabilistic framework for robust ORF identification across diverse ribosome profiling protocols.
一句话提出RiboBA，通过建模实验方案偏倚，改善周期性减弱的核糖体测序数据中的非经典ORF识别。
研究问题
数据与样本
分析流程
- 1构建参考与候选ORF：每个基因优先选择CDS最长的代表转录本，长度相同时按转录本总长选择，再从候选起始密码子扫描至首个同框终止密码子。
- 2预处理与比对：使用Cutadapt保留15–45 nt且碱基质量≥20的读段，用Bowtie去除rRNA和tRNA读段，再依次比对蛋白编码与长非编码转录本。
- 3建立偏倚生成模型：将观测片段视为潜在P位点经实验方案依赖性转换的结果，联合描述5′端添加、核酸酶切割和连接效率偏倚。
- 4推断参数与占据情况：先估计5′端添加分布并重加权片段计数，再用类EM交替优化推断P位点占据和切割参数，最后以带偏置项的对数链接回归估计连接偏倚。
- 5识别翻译区域：用注释CDS、移位零模型、错框对照及伪短ORF构建训练数据，以覆盖度、3-nt周期性和位置趋势特征训练随机森林，并按ORF类别设置阈值。
- 6细化翻译起始位点：以注释CDS起点及替代同框ATG训练XGBoost，结合30-nt局部P位点窗口和侧翼序列，在留出验证集上以F1分数优化阈值。
- 7开展基准与验证：通过已知P位点模拟、位置扰动对照及多种实际数据与其他ORF工具比较，并结合免疫肽组学和果蝇案例评估候选ncORF。
关键方法与工具
- RiboBA
- 偏倚建模与ORF识别
- Cutadapt
- 去接头及读段质控
- Bowtie
- 污染过滤与转录本比对
- ranger
- 随机森林翻译区域分类
- XGBoost
- 预测翻译起始位点
- EM-like alternating optimization
- 联合推断占据与切割参数
- NCBI SRA
- 获取实际核糖体测序数据
- immunopeptidomics
- 提供ORF翻译验证证据
设计思路
主要发现
- 在P位点已知的模拟中，RiboBA相较固定偏移量方法改善了核苷酸和密码子水平P位点的精确指派。
- 模拟与实际数据评测表明，RiboBA能够准确恢复实验方案相关参数，并改善ncORF识别。
- 优势在周期性减弱的RNase I文库及MNase、nuclease P1数据集中尤为明显，同时保持有竞争力的运行时间。
- 果蝇案例识别出具有编码潜能的候选ncORF，包括ThrRS和Mettl2中反复出现的上游翻译，提示其与苏氨酸相关翻译调控存在联系。
可借鉴之处
- 分析不同建库方案的Ribo-seq数据时，可借鉴本文将5′端添加、切割和连接偏倚显式纳入生成模型的做法，而非仅依赖原始周期性信号。
- 短ORF阳性样本不足时，可参考本文从长ORF截取片段构造伪短ORF，并结合移位与错框对照构建监督学习训练集。
- 评估ORF识别方法时，可借鉴“已知真值模拟—多实验方案实际数据—正交肽组证据”的证据链，并在肽段验证前排除与已知CDS同框重叠的候选。
数据与代码
局限
- 每个基因仅选用一个代表转录本构建搜索空间，结果受这一转录本选择策略约束。
- 短ORF训练部分依赖由长ORF构造的伪短ORF，其与真实非经典翻译事件的对应关系仍受训练设计限制。
- 果蝇案例报告的是具有编码潜能的候选ncORF，不能据此视为其生物学功能已获实验证实。
摘要（中文翻译）
核糖体测序（Ribo-seq）通过在全基因组范围内定位核糖体保护片段，揭示了常规编码序列之外广泛存在的翻译活动，发现了在多种生物学过程中发挥作用的非经典开放阅读框（ncORFs）。然而，当Ribo-seq数据集的周期性减弱时，稳健识别ncORF仍然具有挑战性。建库过程中由实验方案引入的偏倚是造成这种周期性丧失的重要因素，但大多数ORF识别工具并未显式建模这些失真。在此，我们提出RiboBA，这是一个用于从Ribo-seq数据中稳健识别ORF的偏倚感知概率框架。RiboBA结合了一个联合推断实验方案引入的偏倚与密码子水平核糖体占据情况的生成模块，以及一个从偏倚校正后的信号中识别已翻译ORF和起始位点的监督学习模块。在P位点位置已知的模拟中，与传统固定偏移量方法相比，RiboBA提高了核苷酸和密码子水平P位点的精确指派表现。在模拟及多种实际Ribo-seq数据集上，结合正交免疫肽组学证据，RiboBA能够准确恢复实验方案相关参数并改善ncORF识别；对于周期性减弱的RNase I文库，以及MNase和nuclease P1数据集，其优势尤为明显，同时保持了有竞争力的运行时间。在一项果蝇案例研究中，RiboBA识别出具有编码潜能的候选ncORF，包括ThrRS和Mettl2中反复出现的上游翻译，将ncORF翻译与苏氨酸相关的翻译调控联系起来。
英文原文摘要
By mapping ribosome-protected fragments genome-wide, ribosome profiling (Ribo-seq) has uncovered extensive translation beyond conventional coding sequences, revealing non-canonical ORFs (ncORFs) with roles in diverse biological processes. However, robust ncORF identification remains challenging when Ribo-seq datasets exhibit attenuated periodicity. Protocol-induced biases during library construction is an important contributor to this loss, yet most ORF callers do not explicitly model these distortions. Here, we present RiboBA, a bias-aware probabilistic framework for robust ORF identification from Ribo-seq data. RiboBA combines a generative module that jointly infers protocol-induced biases and codon-level ribosome occupancy with a supervised module that identifies translated ORFs and initiation sites from the bias-adjusted profiles. In simulations with known P-site positions, RiboBA improved exact nucleotide- and codon-level P-site assignment relative to a conventional fixed-offset approach. Across simulations and diverse empirical Ribo-seq datasets, together with orthogonal immunopeptidomics evidence, RiboBA accurately recovers protocol-induced parameters and improves ncORF identification, with pronounced advantages for RNase I libraries with attenuated periodicity, and for MNase and nuclease P1 datasets, while maintaining competitive runtimes. In a Drosophila case study, RiboBA identified candidate ncORFs with coding potential, including recurrent upstream translation in ThrRS and Mettl2, linking ncORF translation to threonine-related translational regulation.
摘要来自 PubMed。翻译与解读由模型根据摘要和开放获取全文的方法部分生成，可能有误，不构成诊疗建议；数据以原文为准，版权归原出版方所有。